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一.    石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象？

一般來說，如果用多聚賴氨酸包被過的片子做正常免疫組織化學(xué)染色的話是不會掉片子的。但如果要做抗原修復(fù)的話，如果片子處理不好的話是有可能掉片子的。你可以試試一下的方法：

1.一般用APES：丙酮=1:50的處理液來處理片子，處理5min左右，然后水洗，烘干既可用于貼片。如果把水滴再處理好的片子上，水比較聚的話說明片子處理的好。

2.貼片子的時候，展片的時間要把握好，不要太長，否則不利于貼牢。

3.烤片子也很重要，切好的片子最好先不要馬上收起來，而是水平至于烘片臺上37度兩個小時以上，一是水分徹底烘干。然后做染色前最好再在60度烘箱烘1個小時。

4.再補充一點 ，石蠟包埋時，酒精梯度脫水以及浸蠟等一點要充分，這對貼片也有影響。

如果這些導(dǎo)致掉片的因素都已經(jīng)排除但是片子還是掉的厲害，那么也可能是以下原因造成的：

1、多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問題。我原先是買的，邁新按說也是不錯的，可是都脫成什么樣子了。后面補做第二批時用的病理科老師自己做的片子，要好一點。

2、組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。

3、組織的問題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。

4、沒烤好，時間短溫度不夠之類。

5、操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。

6、修復(fù)的問題：抗原修復(fù)的時候高壓時間過長了，或者放進(jìn)100度的修復(fù)液時手法不好，咚的一聲就丟進(jìn)去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時候也沒辦法，只有從另外的問題上著手。

此外，一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹(jǐn)慎，用PBS的時候盡量用泡的，不要沖。基本上把這些方面都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。

二. DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？

著色不均勻可能與你的實驗手法有很大關(guān)系，可能原因有：

1.切出的片子厚度本身可能就不一樣，切出一片厚，一片薄，這樣可能造成著色深淺不一。

2.有可能是你 顯色液底物加到片子上后沒有搖勻，造成局部底物濃度不一致，所以加完顯色液后最好將片子來回左右晃動幾下，使片子上所有區(qū)域的底物濃度一致。

3.如果你的片子是中間的染色深，靠近邊上的淺，那有可能是你蠟圈畫的太小，顯色液覆蓋的面積不過大而產(chǎn)生了邊緣效應(yīng)。最外側(cè)的組織片最好離顯色液外緣0.5cm。

三. 切片染色后背景太深，不易區(qū)分特異性與非特異性著色？

a.也許是抗體本身有問題，因為有很多公司的抗體質(zhì)量并不好，很容易上背景，可以換一種抗體 試試。

b.如果經(jīng)費不允許換抗體的話，你可降低抗體的濃度，并隨時注意觀察顯色，在能看到信號的情況下盡量降低背景。

c.可以換一種封閉液，不同的封閉液對某種來源的抗體來說，會有不同的封閉效果。

d.可以在一抗和二抗中加入一定比例的你所檢測動物組織的正常血清，這樣可以去除一部分非特異性染色。

全片著色

全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有：

（1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對其工作濃度進(jìn)行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡單的按說明書進(jìn)行染色。

（2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，最好隨身佩帶報時表或報時鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。現(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統(tǒng)的1小時，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。

（3）DAB變質(zhì)和顯色時間太長：DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會 游離出 氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到 理想的染色程度時立即終止反應(yīng)。不過當(dāng)染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現(xiàn)實，但至少應(yīng)對一些新的或少用的抗體顯色時進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時間過長。

（4）組織變干：修復(fù)液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。

（5）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時間太長（大于24小時）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組 化染 色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4?C冰箱過夜，對結(jié)果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時間太 長。

（6）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時最好設(shè)立陽性對照和用使用過的抗體作比較。

四. 免疫組化結(jié)果老是出現(xiàn)陰性結(jié)果？

免疫組化出現(xiàn)陰性結(jié)果有可能組織本身就沒有信號，也有可能是抗體出了問題。可以找一些陽性組織做一下，以確定是抗體的問題還是組織本身就沒有所檢測的抗原表達(dá)。還有，可以提高抗體的濃度，或者試一試抗原修復(fù)等方法，也許會得到意想不到的結(jié)果。

五. 一抗從4度拿出后，為什么有人說要37度復(fù)溫，目的是什么？

1. 一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片；

2. 另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要,但對表達(dá)較弱的抗原可能有用,4度和37度時分子運動方式不同,前者分子碰撞機率和運動速度小于后者,后者結(jié)合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。

六. 免疫組化中抗原修復(fù)的最佳條件是什么？尤其是微波修復(fù)。

關(guān)于抗原修復(fù)，我個人的觀點和panther75有點不同。我試過的修復(fù)條件有EDTA熱修復(fù)，檸檬酸鈉為緩沖液的微波修復(fù)以及高壓鍋修復(fù)。從我的實驗結(jié)果 來看，微波修復(fù)其實很不容易掉片子的，而EDTA熱修復(fù)和高壓鍋修復(fù)是很容易掉片子的。因為掉片子主要是因為加熱過程中產(chǎn)生的氣泡所引起，而微波修復(fù)水加 熱到沸騰，沾在片子上的氣泡就會少，不會因為小氣泡上串引起脫片。做EDTA修復(fù)時，你可以將片子靠的盡量近些，或是在載玻片四周墊些棉花什么的，然后蓋 上蓋玻片，這樣修復(fù)的話就能夠盡量減少載玻片上小氣泡的形成。

我們用的微波修復(fù)條件為：

2.94g檸檬酸三鈉溶于1000ml的水，調(diào)ph值至6.0，微波修復(fù)10分鐘。你可以試試，時間可以根據(jù)需要自己調(diào)整。

七. 有人在一抗孵育前用tritonX100來通透細(xì)胞，對石蠟切片需要否？

用石蠟切片做免疫組化是不需要透膜處理的，一是因為石蠟切片比較薄，另外一個原因我認(rèn)為是在包埋過程中細(xì)胞膜已經(jīng)被破壞，所以這一步可以省略。

八. 蘇木素復(fù)染的時間應(yīng)該是多少？復(fù)染過度咋辦？

復(fù)染時間不需要太長，當(dāng)然這也要根據(jù)蘇木精的質(zhì)量來確定，但基本上不要超多一分鐘。染色過深的話可以用酸性的水溶液（在水里滴加少量濃鹽酸）分色，分色的另 外一個目的是洗掉蘇木精在細(xì)胞質(zhì)中的非特異性結(jié)合，這樣可以使細(xì)胞質(zhì)中的特異信號更明顯。所以不管復(fù)染是不是過度，分色這一步最好不要省掉。分色后記得再 用氨水返藍(lán)一下。

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